《细胞》：免疫治疗获重大突破！中国科学家发现响应免疫检查点抑制剂的肿瘤特异性记忆T细胞丨科学大发现
*仅供医学专业人士阅读参考
PD-1/PD-L1抑制剂治疗已经成为肿瘤免疫治疗领域的一个标杆，但是我们还没有完全搞明PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用的机制。
越来越多的证据表明，终末耗竭的T细胞无法被“拯救”，只有还未完全耗竭的T细胞才能响应PD-1/PD-L1抑制剂的治疗[1]。长久以来，科学家一直在寻找真正响应PD-1/PD-L1抑制剂的那一群“尚且能战”的CD8+T细胞。而现在，我们或许真的找到了这群细胞！
近期，由第三军医大学叶丽林、许力凡，中山大学中山医学院唐忠辉和南京大学鼓楼医院孙倍成领衔的研究团队，在顶级学术期刊《细胞》上发表重要研究成果[2]。
他们首次发现，肿瘤引流淋巴结（TdLN）中存在一群TCF-1+TOX-肿瘤特异性记忆CD8+T细胞（TTSM），它们具有强大的抗肿瘤能力，并且是真正响应PD-1/PD-L1抑制剂的CD8+T细胞亚群。
换言之，科学家终于找到了PD-1/PD-L1抑制剂发挥疗效的细胞基础。论文的共同第一作者为：南方医科大学的黄启钊、中山大学中山医学院的吴霞、第三军医大学的王志明和南方医科大学的陈香宇。
论文首页截图
肿瘤引流淋巴结（TdLN）是免疫系统对抗肿瘤的前沿兵站，肿瘤特异性T细胞也会由此出动，前往战场。研究团队希望能够观察肿瘤特异性CD8+T细胞在TdLN中的分化情况，以此进一步探究增强T细胞抗肿瘤能力的方法。
此前的研究表明，只有表达TCF-1的T细胞才能够响应于PD-1抑制剂[3]，因此研究团队使用了P14-TCF-1-GFP报告细胞（这种CD8+T细胞专门识别LCMV病毒抗原Gp33，并且TCF-1后面加上GFP用来报告TCF-1的表达情况，全文中所有P14细胞均为这种报告细胞）。他们将P14-TCF1-GFP细胞转输至皮下种植了B16-Gp33的荷瘤小鼠体内。
对肿瘤内部以及TdLN中P14-TCF-1-GFP细胞进行流式检测后，研究团队发现，肿瘤内部大部分P14细胞TCF-1转阴，而TdLN中的P14细胞基本都保留了TCF-1，这表明TdLN中的肿瘤特异性CD8+T细胞处于一种比较健壮的状态。
TdLN中的P14细胞基本保持TCF-1阳性
同时，他们发现TdLN中的P14细胞表达典型的记忆T细胞标志物（如CD127、CD122和CD62L）。转输实验结果表明，相比于肿瘤内分离出的P14细胞，来自TdLN中的P14对LCMV病毒感染具有更好的保护力，并且与经典的记忆T细胞具有同等的长期维持能力。
这些数据表明，TdLN中的肿瘤特异性CD8+T细胞具有典型的记忆T细胞表型和功能。
TdLN中的肿瘤特异性T细胞具有记忆细胞的特征
接下来，研究团队检测了TdLN和肿瘤微环境（TME）中TCF-1+P14细胞上耗竭相关标志物的表达水平，发现相比于TME中TCF-1+P14细胞，TdLN中的P14细胞仅表达较低水平的PD-1，而且几乎不表达其他的耗竭标志物。
通过对TdLN以及TME中的肿瘤特异性CD8+T细胞进行单细胞测序分析，研究团队发现TdLN中的P14细胞在转录组特征上与经典的记忆性T细胞非常接近，而与TME中的耗竭前体T细胞（TPEX）相差较大。
这些数据再次表明，TdLN中的肿瘤特异性T细胞处于功能较强的状态，耗竭程度很低，并且具有记忆T细胞的特征。
TdLN中肿瘤特异性CD8+T细胞耗竭程度更低，并且具有记忆T细胞的转录特征
我们都知道，TOX是一个耗竭细胞特征性转录因子，也在TCF-1+TPEX中表达。那么在TdLN中，TCF-1+CD8+TCD8+细胞是否也会表达TOX呢？如果是的话，那么TCF-1+TOX-CD8+T细胞和TCF-1+TOX+CD8+T细胞之间又存在怎样的差异呢？
为了探究上述问题，研究团队构建了LUAD小鼠模型，结果发现相比于TCF-1+TOX+CD8+T细胞，TCF-1+TOX-CD8+T细胞表达更高水平的记忆T细胞标志物，而低表达PD-1。转输实验也表明，TCF-1+TOX-CD8+T细胞具有更好的持留能力与记忆反应能力。
这说明，TCF-1+TOX-CD8+T细胞是耗竭程度更低，记忆潜能更强的细胞亚群。研究人员将它们称为：肿瘤引流淋巴结来源的肿瘤特异性记忆细胞（TdLN-TTSM）。
TCF-1+TOX-CD8+T细胞耗竭程度更低，并具有记忆功能
那么在肿瘤患者体内是否同样存在这群TCF-1+TOX-CD8+T细胞呢？为了回答这个问题，研究团队分离了肝细胞癌（HCC）患者TdLN以及TME中的活化CD8+T细胞，并进行了单细胞转录组测序以及TCR测序。
聚类分析结果显示，来自TdLN中的肿瘤特异性CD8+T细胞大多是TCF-1+TOX-TTSM样细胞，而来自TME中等肿瘤特异性CD8+T细胞大多为TPEX（TCF-1+TOX+）和TEX（TCF-1-TOX+）。伪时间分析表明，TME中的肿瘤特异性T细胞主要起源于TdLN中对应的TTSM细胞克隆。
为了探究TdLN-TTSM的抗肿瘤能力，研究团队从TTSM样亚群中选择了6个TCR克隆，将其转染至患者自体T细胞中，并将其与自体肿瘤细胞共培养，结果显示6个TCR克隆中的5个能够识别自体肿瘤细胞，并且使T细胞释放IFN-γ。
这些证据表明，在HCC患者体内存在TdLN-TTSM，并且这群细胞具有抗肿瘤潜力。
HCC患者体内也存在TdLN-TTSM
为了更好地探究TdLN-TTSM的抗肿瘤能力，研究团队分离了TdLN-TTSM并将其转输至荷瘤小鼠体内。结果显示，相比于TPEX和TEX，转输TdLN-TTSM的小鼠肿瘤生长几乎停滞，并且在40天的实验中100%存活，而转输TPEX和TEX的小鼠已经全部死亡。
这些数据表明，TdLN-TTSM具有强大的抗肿瘤活性。
TdLN-TTSM具有强大的抗肿瘤活性
那么在PD-1/PD-L1抑制剂治疗中，TdLN-TTSM发挥了怎样的作用呢？
为了探究这个问题，研究团队首先去除了小鼠的TdLN，随后给予PD-L1抑制剂治疗，发现在去除TdLN后PD-L1抑制剂的治疗效果消失，这表明PD-L1抑制剂治疗产生效果的基础在于TdLN中而不是TME中的肿瘤特异性细胞。
随后，研究团队将同样数量的TdLN-TTSM和TdLN-TPEX转输至荷瘤小鼠中，并对小鼠进行PD-L1抑制剂治疗，发现在治疗后受者小鼠体内TdLN-TTSM来源的细胞扩增倍数更多，并且还产生了更多的细胞因子。
此外，研究团队还将同样数量的TdLN-TTSM和TdLN-TPEX转输至去除TdLN的荷瘤小鼠中，在给予PD-L1抑制剂治疗后，转输了TdLN-TTSM的小鼠肿瘤生长更加缓慢，肿瘤重量明显降低。
这些数据表明，TdLN中的TdLN-TTSM细胞是响应PD-1/PD-L1治疗的主要细胞群体。
TdLN-TTSM是PD-L1抑制剂治疗的主要应答者
以上研究成果可以总结成三点：①PD-L1抑制剂会促进TdLN-TTSM细胞大量扩增，导致TPEX和TEX细胞在肿瘤微环境中聚集；②向TdLNs内注射PD-L1抑制剂能有效地抑制肿瘤的生长，而在肿瘤内注射PD-L1抑制剂则没有显著的肿瘤控制效果；③手术切除TdLNs后，PD-L1抑制剂的抗肿瘤效果消失，而转输TdLN-TTSM细胞可以恢复PD-L1抑制剂对TdLN切除者肿瘤的控制。
总的来说，这个研究扎实地证实：TdLN-TTSM细胞才是PD-1/PD-L1抑制剂的真正响应者。也正是基于这一研究成果，研究团队提出了一个PD-1/PD-L1抑制剂发挥作用的时空流程假说：PD-1/PD-L1抑制剂治疗首先在TdLN扩增TTSM细胞，并进一步驱动这些细胞分化为TdLN中的TPEX细胞；随后，TdLN来源的TPEX细胞迁移到肿瘤微环境中，最后分化为TEX细胞，而免疫检查点抑制剂可以维持这些新分化的TEX细胞的效应功能，从而有效地对抗肿瘤细胞。当然，这个假说还需要临床前和临床数据的进一步验证。
值得一提的是，这项研究也给术前免疫新辅助治疗提供了机制上的支持。此外，这项研究还给肿瘤外科医生提了个醒，在清扫患者的淋巴结之后，或许能从淋巴结中分选扩增TTSM细胞，回输给患者提高免疫治疗的效果。
我相信，除了以上的潜在价值之外，这个研究肯定还存在其他的价值点，欢迎在文末分享你的理解和洞察。
参考文献：
1. S. Kurtulus, et al.Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1−CD8+ tumor-infiltrating T cells.Immunity, 50 (2018),181–194.e6
2. Huang et al, The primordial differentiation of tumor-specific memory CD8+ T cells as bona fide responders to PD-1/PD-L1 blockade in draining lymph nodes, Cell (2022), https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.09.020
3. B.C. Miller, et al.Subsets of exhausted CD8+ T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.Nat. Immunol., 20 (2019), pp. 326-336
责任编辑丨BioTalker
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